24

DNA测序是指测定核酸序列的过程。Sanger测序是目前中仍在使用的一种测序方法。Frederick Sanger和collogues于1977年引入了“双脱氧”链终止法,并最终用于对整个人类基因组进行测序。人类基因组计划完成后,为了简化测序工作,出现了下一代测序机器。

Sanger测序

在Sanger测序中,每个测序反应由测序引物、脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、DNA聚合酶、DNA序列和标记的双脱氧核苷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP)组成,双脱氧核苷酸比脱氧核苷酸的使用要少得多。双脱氧核苷酸与DNA链的结合阻止了任何其他核苷酸的进一步添加,因此每个片段都以一个标记的核苷酸结束。然后,毛细管凝胶电泳根据DNA序列的长度将其分离,激光激发每个序列末端核苷酸上的标签并生成色谱图。色谱图显示每个核苷酸的荧光峰和序列中核苷酸的顺序。

下一代测序

经过13年的努力,人类基因组计划于2003年完成。人类基因组计划使用Sanger测序法测序,耗费30亿美元。在人类基因组计划以如此巨大的成本和时间完成后,由于测序技术的需要而出现了下一代测序技术。从那时起,各测序公司分别开发了不同的高通量测序方法。例如,Illumina合成测序、Pacific Biosciences公司单分子实时测序,Ion Torrent公司的离子半导体测序、SOLiD公司连接测序等。截至2019年,Illumina、Qiagen和ThermoFisher Scientific是高通量测序产品开发的企业领导者。目前,Illumina拥有90%的测序市场,具有高保真度(准确度>99.9%)。
20世纪90年代以来,测序能力有了显著提高。2005年随着Illumina基因组分析仪系统的引入,每年能够处理1.3个人类基因组。近10年后,随着Illumina HiSeq X 10系列测序系统的出现,每年处理数量增加到18000个人类基因组。此外,高通量测序系统的引入使得测序成本显著降低。虽然完成人类基因组计划耗费了13年和30亿美元,但目前我们可以在一天内对45个人类基因组进行测序,每个测序大约1000美元。

 

 

下一代测序的应用

近年来,在诊断医学和临床医学的实践中取得了重大的技术进步,使人们对遗传病有了更好的认识。单基因和多基因板及检测、全基因组测序(WGS)、全外显子组测序(WES)和无细胞DNA无创性产前检测等都是采用测序技术进行的分子检测。靶向外显子组测序在肿瘤学中越来越流行,用于评估癌症相关基因的全序列。下一代测序可用于RNA测序(RNA seq),也可用于循环肿瘤RNA(ctRNA)的发现。此外,芯片测序(ChIP seq)是染色质免疫沉淀(ChIP)和下一代测序的结合,有助于分析蛋白质与DNA的相互作用。下一代测序的其他应用包括进化生物学、法医学、移植排斥反应和病原体检测。

文库和样品制备是下一代测序中一个费时费力的步骤。在文库准备过程中,适配器会被连接到片段基因组DNA的两端。许多科学家专注于自动化液体处理工作站,以便自动化制备文库,为下一代测序分析做准备。Aurora Biomed 公司为下一代测序文库制备提供自动化系统,该系统有着以下的优势:1)没有交叉污染迹象;2)文库产量再现性高;3)文库产量质量高。

0 No comments

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注